CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals

La Retinosi Pigmentària (RP), la causa de ceguesa més freqüent en adults (1:4000), està originada per mutacions en més de 50 gens. Un d’aquests és CERKL, gen identificat l’any 2004 pel grup, l’estudi funcional del qual constitueix el tema d’aquesta Tesi Doctoral. Fins el moment, s’han descrit vàries...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Garanto Iglesias, Alejandro
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2011
País:España
Institución:CBUC, CESCA
Repositorio:TDR. Tesis Doctorales en Red
OAI Identifier:oai:www.tdx.cat:10803/96312
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10803/96312
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Retinosi pigmentària
Distròfia de retina
Models animals
Esfingolípids
Esfingolípidos
Sphingolipids
Retinosis pigmentaria
Retinitis pigmentosa
Retinal dystrophy
Modelos animales
Animal models
CERKL
Ciències Experimentals i Matemàtiques
575
id ES_19fb5abd16853aa6ad148667a7365dd0
oai_identifier_str oai:www.tdx.cat:10803/96312
network_acronym_str ES
network_name_str España
repository_id_str
dc.title.none.fl_str_mv CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals
title CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals
spellingShingle CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals
Garanto Iglesias, Alejandro
Retinosi pigmentària
Distròfia de retina
Models animals
Esfingolípids
Esfingolípidos
Sphingolipids
Retinosis pigmentaria
Retinitis pigmentosa
Retinal dystrophy
Modelos animales
Animal models
CERKL
Ciències Experimentals i Matemàtiques
575
title_short CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals
title_full CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals
title_fullStr CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals
title_full_unstemmed CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals
title_sort CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals
dc.creator.none.fl_str_mv Garanto Iglesias, Alejandro
author Garanto Iglesias, Alejandro
author_facet Garanto Iglesias, Alejandro
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Gonzàlez-Duarte, Roser
Marfany i Nadal, Gemma
Universitat de Barcelona. Departament de Genètica
dc.subject.none.fl_str_mv Retinosi pigmentària
Distròfia de retina
Models animals
Esfingolípids
Esfingolípidos
Sphingolipids
Retinosis pigmentaria
Retinitis pigmentosa
Retinal dystrophy
Modelos animales
Animal models
CERKL
Ciències Experimentals i Matemàtiques
575
topic Retinosi pigmentària
Distròfia de retina
Models animals
Esfingolípids
Esfingolípidos
Sphingolipids
Retinosis pigmentaria
Retinitis pigmentosa
Retinal dystrophy
Modelos animales
Animal models
CERKL
Ciències Experimentals i Matemàtiques
575
description La Retinosi Pigmentària (RP), la causa de ceguesa més freqüent en adults (1:4000), està originada per mutacions en més de 50 gens. Un d’aquests és CERKL, gen identificat l’any 2004 pel grup, l’estudi funcional del qual constitueix el tema d’aquesta Tesi Doctoral. Fins el moment, s’han descrit vàries mutacions en CERKL causants d’RP o de distròfia de cons i bastons (CRD). A nivell proteic, CERKL presenta un 50% de similitud amb la proteïna quinasa de ceramides (CERK) i comparteix el domini diacilglicerol quinasa (DAGK). Endemés, CERKL presenta diferents dominis proteics coneguts (senyals de localització (NLS) i d’exportació (NES) nuclear, així com un domini d’homologia a plextrina (PH)). Tot i que s’han identificat mutacions que indubtablement causen degeneració retinal, encara resta per descriure la seva funció fisiològica, així com la seva contribució a la patologia. L’objectiu principal d’aquest treball ha estat la caracterització funcional del gen i la proteïna CERKL a partir d’assaigs in vitro, combinant estratègies in silico, cel•lulars i moleculars, profunditzant en les anàlisis quantitatives i qualitatives dels principals esfingolípids. Finalment, també s’ha construït i analitzat un model animal murí knockout, Cerkl -/-. Els principals resultats obtinguts en aquest treball s’enumeren a continuació: 1.- A nivell transcripcional, s’han caracteritzat de forma exhaustiva les isoformes produïdes per CERKL en retina humana i murina, revelant un nivell de complexitat inesperat, amb més de 20 isoformes, degudes principalment a empalmament alternatiu, així com a la presència de, com a mínim, quatre promotors diferents amb especificitat tissular. 2.- Estudis cel•lulars de sobreexpressió mostren que CERKL exerceix un efecte protector davant l’apoptosi causada per estrès oxidatiu, mentre que les formes mutants no retenen aquesta funció. Encara que els mecanismes de protecció es desconeixen, aquests resultats apunten a una funció neuroprotectora a curt termini de CERKL als fotoreceptors, els quals estan sotmesos de manera continuada a estrès lumínic i oxidatiu. 3.- Estudis exhaustius i detallats mitjançant tècniques de TLC, HPLC i UPLC per l’anàlisi de lípids han demostrat que CERKL no fosforila les ceramides ni cap dels esfingolípids identificats fins el moment, sota les condicions utilitzades. Tampoc s’ha pogut observar una funció quinasa de proteïnes. Els resultats obtinguts en aquest treball apunten a que CERKL ha d’exercir una altra funció a la cèl•lula, molt probablement lligada al transport de lípids o a la regulació d’altres processos cel•lulars. 4.- La localització subcel•lular ha determinat que CERKL localitza, principalment, al reticle endoplasmàtic i a l’aparell de Golgi i, de manera minoritària, al nucli, mostrant una localització extremadament dinàmica que recolza la contribució de CERKL en processos de transport i senyalització, així com una multiplicitat funcional. 5.- Un dels aspectes claus d’aquesta Tesi ha estat el disseny, generació i estudi fenotípic a nivell transcripcional, cel•lular, morfològic, electroretinogràfic i lipidòmic del model animal Cerkl-/-. El ratolí Cerkl-/- és viable i fèrtil, i els nostres estudis preliminars no mostren una degeneració de retina severa. El fenotip dels ratolins KO mostra una alteració significativa i consistent dels potencials oscil•latoris als electroretinogrames, els quals indiquen una afectació de les cèl•lules ganglionars i/o amacrines. Aquestes dades concorden amb les anàlisis immunohistoquímiques i d’hibridació in situ en retines de ratolí WT i KO, on la màxima expressió de CERKL es detecta en les cèl•lules ganglionars, i de manera més moderada, en la capa nuclear interna i fotoreceptors. En resum, CERKL és un gen que mostra una gran complexitat transcripcional i funcional. Els pròxims objectius abordaran l’estudi en detall del model animal generat, així com d’altres models en vies de construcció.
publishDate 2011
dc.date.none.fl_str_mv 2011
2012
2012
dc.type.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
info:eu-repo/semantics/publishedVersion
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.none.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10803/96312
url http://hdl.handle.net/10803/96312
dc.language.none.fl_str_mv Catalán
language_invalid_str_mv Catalán
dc.rights.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv 225 p.
application/pdf
application/pdf
application/pdf
application/pdf
application/pdf
application/pdf
application/pdf
application/pdf
application/pdf
dc.publisher.none.fl_str_mv Universitat de Barcelona
publisher.none.fl_str_mv Universitat de Barcelona
dc.source.none.fl_str_mv TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)
reponame:TDR. Tesis Doctorales en Red
instname:CBUC, CESCA
instname_str CBUC, CESCA
reponame_str TDR. Tesis Doctorales en Red
collection TDR. Tesis Doctorales en Red
repository.name.fl_str_mv
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1869404078537179136
spelling CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionalsGaranto Iglesias, AlejandroRetinosi pigmentàriaDistròfia de retinaModels animalsEsfingolípidsEsfingolípidosSphingolipidsRetinosis pigmentariaRetinitis pigmentosaRetinal dystrophyModelos animalesAnimal modelsCERKLCiències Experimentals i Matemàtiques575La Retinosi Pigmentària (RP), la causa de ceguesa més freqüent en adults (1:4000), està originada per mutacions en més de 50 gens. Un d’aquests és CERKL, gen identificat l’any 2004 pel grup, l’estudi funcional del qual constitueix el tema d’aquesta Tesi Doctoral. Fins el moment, s’han descrit vàries mutacions en CERKL causants d’RP o de distròfia de cons i bastons (CRD). A nivell proteic, CERKL presenta un 50% de similitud amb la proteïna quinasa de ceramides (CERK) i comparteix el domini diacilglicerol quinasa (DAGK). Endemés, CERKL presenta diferents dominis proteics coneguts (senyals de localització (NLS) i d’exportació (NES) nuclear, així com un domini d’homologia a plextrina (PH)). Tot i que s’han identificat mutacions que indubtablement causen degeneració retinal, encara resta per descriure la seva funció fisiològica, així com la seva contribució a la patologia. L’objectiu principal d’aquest treball ha estat la caracterització funcional del gen i la proteïna CERKL a partir d’assaigs in vitro, combinant estratègies in silico, cel•lulars i moleculars, profunditzant en les anàlisis quantitatives i qualitatives dels principals esfingolípids. Finalment, també s’ha construït i analitzat un model animal murí knockout, Cerkl -/-. Els principals resultats obtinguts en aquest treball s’enumeren a continuació: 1.- A nivell transcripcional, s’han caracteritzat de forma exhaustiva les isoformes produïdes per CERKL en retina humana i murina, revelant un nivell de complexitat inesperat, amb més de 20 isoformes, degudes principalment a empalmament alternatiu, així com a la presència de, com a mínim, quatre promotors diferents amb especificitat tissular. 2.- Estudis cel•lulars de sobreexpressió mostren que CERKL exerceix un efecte protector davant l’apoptosi causada per estrès oxidatiu, mentre que les formes mutants no retenen aquesta funció. Encara que els mecanismes de protecció es desconeixen, aquests resultats apunten a una funció neuroprotectora a curt termini de CERKL als fotoreceptors, els quals estan sotmesos de manera continuada a estrès lumínic i oxidatiu. 3.- Estudis exhaustius i detallats mitjançant tècniques de TLC, HPLC i UPLC per l’anàlisi de lípids han demostrat que CERKL no fosforila les ceramides ni cap dels esfingolípids identificats fins el moment, sota les condicions utilitzades. Tampoc s’ha pogut observar una funció quinasa de proteïnes. Els resultats obtinguts en aquest treball apunten a que CERKL ha d’exercir una altra funció a la cèl•lula, molt probablement lligada al transport de lípids o a la regulació d’altres processos cel•lulars. 4.- La localització subcel•lular ha determinat que CERKL localitza, principalment, al reticle endoplasmàtic i a l’aparell de Golgi i, de manera minoritària, al nucli, mostrant una localització extremadament dinàmica que recolza la contribució de CERKL en processos de transport i senyalització, així com una multiplicitat funcional. 5.- Un dels aspectes claus d’aquesta Tesi ha estat el disseny, generació i estudi fenotípic a nivell transcripcional, cel•lular, morfològic, electroretinogràfic i lipidòmic del model animal Cerkl-/-. El ratolí Cerkl-/- és viable i fèrtil, i els nostres estudis preliminars no mostren una degeneració de retina severa. El fenotip dels ratolins KO mostra una alteració significativa i consistent dels potencials oscil•latoris als electroretinogrames, els quals indiquen una afectació de les cèl•lules ganglionars i/o amacrines. Aquestes dades concorden amb les anàlisis immunohistoquímiques i d’hibridació in situ en retines de ratolí WT i KO, on la màxima expressió de CERKL es detecta en les cèl•lules ganglionars, i de manera més moderada, en la capa nuclear interna i fotoreceptors. En resum, CERKL és un gen que mostra una gran complexitat transcripcional i funcional. Els pròxims objectius abordaran l’estudi en detall del model animal generat, així com d’altres models en vies de construcció.The main aim of this thesis was the transcriptional and functional characterisation of CERKL, one of the many genes described so far that are responsible for Retinitis Pigmentosa (RP), the main genetic cause of blindness in adults (prevalence 1:4.000). In particular, we aimed to: i) characterise the complex CERKL transcription in human and mouse retinas, ii) analyse the subcellular localisation of the CERKL encoded proteins, including the truncated isoform R257X, generated by the most frequent mutant allele; iii) characterise the substrate and possible enzymatic role of the CERKL protein; iv) describe the role of CERKL in the protection against oxidative stress; and last but not least, v) design, create and initially characterise a mouse Cerkl-/- model (knockout) at the transcriptional, histological, immunohistochemical and lipidomic levels, focussing on the retina. Our results showed a high transcriptional complexity of the CERKL gene in the human and murine retina, with an extremely dynamic subcellular localisation, indicating the possibility of different functional roles in each compartment. The overexpression of CERKL protects cells from induced oxidative stress, suggesting that CERKL might play an important role in the initial response against oxidative injuries. CERKL harbours a conserved lipid kinase domain and the high homology with CERK has suggested a possible involvement in the sphingolipid metabolism. However, up to date, no kinase activity has been detected and the CERKL function remains unclear. In order to elucidate the CERKL physiological function, study its role in the retina, and whether it is (or not) related to sphingolipid metabolism, a knockout mouse was generated. The murine model resulted in a knockdown more than a knockout model, as alternative previously unreported promoters directed basal expression of Cerkl. Initial characterisation of the animal model phenotype showed a consistent and non-progressive alteration of the oscillatory potentials in the electroretinograms, an increase of apoptosis and GFAP protein (gliosis marker), as well as a decrease in Brn3a protein (ganglion cell marker), although no gross morphological changes were detectable. All together, these results point to clear signs of functional alteration at the ganglion cell layer. To determine the CERKL involvement in the sphingolipid metabolism, lipidomic quantification was performed and the analyses of the results are currently in progress.Universitat de BarcelonaGonzàlez-Duarte, RoserMarfany i Nadal, GemmaUniversitat de Barcelona. Departament de Genètica201220122011info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion225 p.application/pdfapplication/pdfapplication/pdfapplication/pdfapplication/pdfapplication/pdfapplication/pdfapplication/pdfapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10803/96312TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)reponame:TDR. Tesis Doctorales en Redinstname:CBUC, CESCACatalánADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.info:eu-repo/semantics/openAccessoai:www.tdx.cat:10803/963122026-06-14T12:46:07Z
score 15.300719

Similares en LA Referencia